Что же такое НИПТ?
Поскольку это революционная методика, она пришла к нам недавно, но достаточно мощно развивается и распространяется, и поэтому врач акушер-гинеколог, который непосредственно ведёт эту беременность должен хорошо в этом деле разобраться. Та ситуация, которая сейчас идёт в плане понимания НИПТ похожа на ситуацию, которая была в начале 2000 годов, когда появились и широко стали распространяться в России методики пренатального биохимического и ультразвукового скрининга. Тогда мы сталкивались абсолютно с теми же проблемами, что нужно было проводить большую разъяснительную работу с врачами, для того чтобы они могли во всём этом деле разбираться.
Расшифровывается эта английская аббревиатура как «Non-Invasive Prenatal Tasting» синонимом является «Non-Invasive Prenatal Screening», для того чтобы скрининг отличать от «Non-Invasive Prenatal Diagnostic», когда речь уже идёт о диагностике тех состояний, которые выходят за рамки анеуплоидии: различные генетические заболевания, различные генетические синдромы, и это тоже можно делать сейчас по крови матери, только тут немного другие методики, и они отличаются от тех методик, которые применяются при скрининге. И очень важно отметить, что во всех развитых странах это Америка, Австралия , Новая Зеландия, страны Азии, методика НИПТ стала интегральной частью антенатального наблюдения, но практически во всех странах, где это стало частью данного наблюдения, оно является частью добровольного информированного обследования и во всех странах, где уделяют достаточно большое значение НИПТ врач обязан рассказать пациентке о том, что такая методика существует, объяснить её особенности и возможности применения, а также ограничения при методике. Это нужно для того чтобы пациент принял добровольное и абсолютно без какого-либо принуждения решение. Будет ли данная пациентка делать этот анализ или нет, и ошибкой врача на западе на сегодняшний день является не то, что он не направил пациентку на пренатальный скрининг, а то, если он не рассказал пациентке, что такой скрининг возможен или если он не объяснил все нюансы связанные с тем, в каком виде будут получены результаты, и что можно от этого скрининга ожидать. Каждый врач должен дать базовую информацию о скрининге.
НИПТ в Лаборатории ЦИР
Расширенная панель НИПТ в Лаборатории ЦИР
У нас пока что таких регламентирующих документов, о том что врач должен информировать пациентку, нет. Скрининг-интересная область современных исследований, и она революционизировала медицину. Что мы определяем: свободную бесклеточную ДНК в крови пациента и вот представьте, что эта свободная бесклеточная ДНК была в первые обнаружена, причём, как материнская так и фетальная, в 1997 году. Менее чем через 15 лет мы уже имели исследования и абсолютно полностью отработанную методику клинической лабораторной диагностики, которая позволила выявлять очень много значимых проблем внутри организма беременной женщины. Современные методы и практика пренатальной диагностики.
Суть неинвазивного пренатального скрининга
Суть заключается в следующем: есть два источника свободной ДНК в крови матери – это сам материнский организм и организм плода, вернее трофабласт, который посылает в кровь матери маленькие фрагменты расщепленной ДНК. Мы знаем, что обычно ДНК находится внутри клеток внутриклеточного ядра, и поэтому, когда была обнаружена свободная ДНК в крови, это было неожиданное открытие. Вначале думали, что это какая-то погрешность или какая-то патология или какие-то особые состояния или случайность, но в настоящее время оказалось, что это достаточно значимый фактор физиологической регуляции. Есть рецепторы к свободной ДНК и есть ДНК, которая связана с поверхностью клеток, есть различные ткани, которые накапливаются неравномерно или в более высоких концентрациях свободная ДНК. Это очень значимая тема для исследований, но нас интересует, как мы можем это использовать для неинвазивного определения нарушений хромосомного набора плода, прежде всего диагностики или подозрений на наличие синдрома Дауна, как наиболее частой хромосомной аберрации (ошибки), которые встречаются при беременности, но и на другие значимые в плане пренатальной диагностики состояния.
Итак, есть два источника ДНК: ДНК, которая поступает постоянно в течении жизни в организм женщины и у неё есть свои механизмы: механизмы элиминации и деградации, и есть источник поступления абсолютно аналогичный любому метаболиту, она постоянно поступает и постоянно разрушается. И дополнительный источник – это ДНК плода, исследуя которую мы можем сказать есть или нет нарушения со стороны хромосомного набора внутри организма матери. Каким образом мы можем это посмотреть? Существуют особенности фетальной ДНК – они гораздо короче, чем обыкновенный размер тех цепочек материнской ДНК, которая поступает из апоптотических клеток, клеток, которые вступают в запрограммированную клеточную смерть. Таким образом, по размерам длинных цепочек мы можем разделить эти ДНК.
Эти короткие цепочки характеризуют фетальную ДНК, которая поступает на 5 неделе беременности в кровоток, быстро исчезает и перестаёт обнаруживаться в первые же дни после родов, вот на чем основан этот тест.
Какие виды существуют?
Существуют три подхода. Первый подход - самый сложный – это MPС, то есть когда определяется вся ДНК, которая имеется внутри крови человека и путём того, что можно посмотреть чёткие маркеры по каждому фрагменту. Каждый фрагмент может быть отнесён чётко к тому или иному участку генома, и, таким образом, мы получаем полную картинку генома. Нас интересует есть или нет избыток материала, который идёт со стороны плода. Если есть избыток фетальных ДНК, ну допустим есть лишние хромосомы 21 внутри организма плода или внутри клеток плаценты в трофобласте, который собственно говоря является источником поступления этого ДНК, то тогда будет изменено соотношение между ДНК, которая относится к 21 хромосоме, по сравнению с обычным нормальным распределением ДНК. Если мы видим избыток материала из 21 хромосомы, то мы предполагаем, что источником этой ДНК не является 21 хромосома плода. Таким образом, мы оцениваем то, что у внутриутробного плода может быть синдром Дауна.
Также это относится к 18 хромосоме и к 13 хромосоме. Здесь мы можем видеть абсолютно любые хромосомы, если мы делаем MPS и две методики, которые сейчас конкурируют внутри нашего российского рынка. Если брать западные методики-это CSS, которая используется при тесте «rosh harmony», которая делает наша фирма «Генетико». Причём, я понимаю насколько это уникальный случай, когда российская фирма полностью работает по лицензированной западной методике.
Вторая методика, которая тоже присутствует на рынке это TSM PBS THE SEQUENCE нуклеотид полиморфизм, это конкурирующая методика, которая называется панорама. Обе последних методики оценивают только вот эти четыре хромосомы, то есть идут исследования по 21,18,13 и половым хромосомам. Причём, исследования на половые хромосомы иногда выделяется в отдельный фрагмент исследований, потому что по своей значимости это имеет гораздо меньшее значение, чем выявление трисомий, которые вызывают очень грубые пороки развития у детей.
Первая методика скрининга - MPS
MPS (массивный параллельный скрининг)-это быстрое секвенирование всего массива свободной ДНК с разрешением до 1 нуклеотида, иногда получается, что для точной локализации фрагментов тому или иному участку генома достаточны для идентификации последовательностей из 36 пар оснований. Когда мы находим последовательность из 36 пар оснований внутри того или другого фрагмента, мы чётко можем отнести этот фрагмент к тому или иному участку, с какой хромосомы он идёт, и на какой хромосоме исходно определяемый фрагмент находился. Получив эту полную информацию, мы можем с помощью математических алгоритмов получать так называемые девиации (отпадение лишней хромосомы). Эта лишняя хромосома будет давать девиацию, то если её материалы будут больше внутри вот этого исследуемого материала. Здесь оценивается z-оценка, то есть один из статистических показателей. Если мы видим, что значение этой z-оценки больше или равно трём, то тогда соответственно мы предполагаем, что данная 21 хромосома присутствует, есть её избыток, и тогда мы предполагаем, что есть большая вероятность, что у плода есть трисомия по 21 паре, тоже самое относится к 18 к 13 и другим парам.
Я не знаю делают ли в России исследования по этой методике, на Западе она гораздо на порядок дороже, чем те методики, которые выполняются. Здесь, конечно, если делать такие методики, мы можем получать какие-то случайные данные других проблем: повышение рисков или избыток генетического материала не связанного с инсерцией или делеции и микроделецией. Эту информацию мы можем видеть по другим хромосомам только с помощью методик MPS.
Красота методики SSC
SSC позволяет поставить или предположить наличие различных трисомий, то есть анеуплоидий, которые касаются целевых хромосом, с очень большой точностью. Проводится расчёт доли свободной фетальной ДНК по отношению ко всей свободной ДНК, а дальше идёт путем полимеразной цепной реакции обогащение получаемого исследуемого материала, но не по всем хромосомам, а только по 21, 18,13 XY хромосомам. Мы получаем мощнейшую амплификацию, когда концентрация материала плода и материнского организма, который относится к этим хромосомам в материале резко увеличивается, тогда мы можем уже это исследовать, расценивая соотношения между различными факторами и специальные статистические алгоритмы, которые специально были приобретены фирмой «Roche» и называются «forta-feet of action optimistic risk of threesome evaluation».
Таким образом, мы имеем исходные данные, то есть фетальные ДНК, факторы риска, которые могут быть связаны с риском появления тех или иных трисомий внутри той популяции, которая используется, возраст женщины, гестационный срок беременности и так далее. Дальше производится оценка, нет ли внутри получаемого результата повышения сигнала, который идёт со стороны 13,18,21 х или у хромосомы, и тогда мы четко можем сказать, с какой ситуацией или патологией мы можем столкнуться в данном виде исследования. Надо сказать, что этот анализ по своей точности опережает SMP, но, конечно, результат менее точен, чем когда мы берем массивный параллельный скрининг, но это уже другого порядка и гораздо более дорогостоящее.
Что позволяет выяснить CSS?
Мы исследуем риск анеуплоидии, количество копий целевой хромосомы, целевыми хромосомами являются все хромосомы, которые следуют из процента фетальной ДНК, и результат здесь выдается в виде риска, то есть например 1:50. Высоким риском является риск того, что та или иная хромосомная ошибка будет больше чем 1:100. Получается высокая точность, высокая надёжность, дешевле чем MPS и даёт привычный формат для врачей работающих с традиционными программами скрининга. Мы получаем результаты похожие на те результаты, которые мы имеем по биохимическому и ультразвуковому привычному нашему пренатальному скринингу.
SNP - single nucleotide polymorphism
Также очень хорошая методика, основанная на другом принципе, называется SNP- single nucleotide polymorphism или единичные нуклеотидные полиморфизмы. Здесь мы смотрим Лейденовскую мутацию и целый ряд других факторов, которые имеют внутри анализы на полиморфизмы. Это одна из больших разновидностей основных полиморфизмов, которые мы видим, когда одна буква генетического кода заменена на другую и этими SNP называются такие вариации ДНК, которые встречаются больше чем у 1% населения. Если посмотреть достаточно большое количество полиморфизмов, которые имеются в популяции у человека и посмотреть конкретного человека, то это будет как отпечаток пальцев конкретного индивида, потому что у каждого из нас будет свой уникальный набор полиморфизмов, которым мы отличаемся от всех других людей, даже от родных братьев и сестёр, только если он не однояйцевый близнец.
Но если взять примерно 20 тысяч таких полиморфизмов, которые относятся к 13, 18, 21 и половым хромосомам, то мы чётко можем отличить хромосому материнского происхождения от хромосомы, которая идёт со стороны плода, и тогда мы сравниваем результаты скрининга по этим хромосомам с теми результатами, которые получены по определению внутриядерной ДНК из материнских лимфоцитов. Делая анализы на те же полиморфизмы внутриядерной ДНК, мы получаем чёткий генетический «отпечаток пальцев» материнского генома, и тогда мы получаем картинку по этим целевым хромосомам, который мы в общем материале можем чётко отделить - где материнский сигнал, а где фетальный сигнал, определённым алгоритмом пересчитать. Такая вот достаточно сложная методика, но она имеет свои плюсы и минусы. Плюсом можно считать вариант, если мы находим трисомию и чётко можем понять, откуда пришёл источник этой лишней хромосомы: из сперматозоида или из яйцеклетки.
А в общем, мы получаем примерно те же данные, которые мы получаем по методике CSS, но немного другим методом. Но родительский источник лишней хромосомы мы можем сегодня определить только с помощью SNP based. Если есть многоплодная беременность, то есть дополнительный источник шума. Этот источник шума пытаются максимально уменьшить лаборатории, которые с этим работают, и поэтому «Генетико» говорит, что они достаточно хорошо могут определять риски, если речь идёт о двойне, если есть тройня и больше плодов, тут не получится дать достоверной информации, так как шумы будут большие.
Как влияет ЭКО на скрининг?
Если использована донорская яйцеклетка, то мы получаем дополнительно четвертый гаплотип внутри организма женщины, то есть это будет гаплотип, который пришёл из яйцеклетки, но он будет отличаться от женского организма. Получается, есть ещё гаплотип яицеклетки чужой и гаплотип, который эмбрион получил со сперматозоидом, то есть получается четыре разных набора хромосом по 23 хромосомы, и это резко затрудняет диагностику. Но в принципе, донорская яйцеклетка совершенно спокойно смотрится, если лаборатория знает, что это донорская яйцеклетка, поэтому если вы направляете на НИПТ пациентку, которая прошла ЭКО, она должна чётко сказать, была яйцеклетка донорская, либо своя, либо она не знает. Тогда лаборатория будет разбираться и искать источники тех сигналов, если вдруг она получает какой-то дополнительный шум, который не может понять, иначе она может предположить, что у пациентки может быть например опухоль, которая не выявлена.
Другие факторы, влияющие на достоверность скрининга
Если имеется опухоль, про которую пациентка не знает, то она является мощнейшим источником поступления свободной ДНК в кровь, и поэтому это ещё одно направление исследований свободной ДНК в крови человека, так называемая жидкостная биопсия. Только в данном случае берётся анализ крови и внутри анализа крови исследуется уровень потенциально опухолевой ДНК. Если уровень повышен, то тогда с очень большей степенью вероятности можно предположить, что внутри организма имеется онкологический процесс. Мы писали об этом ранее в нашем блоге: Рак у матери по НИПТ и НИПТ может выявить опасные заболевания матери.
А теперь представьте сочетание рака кишечника или желудка. Если есть такой источник, то мы получим такой уровень шума, что не сможем достоверно вычленить внутри этого шума тот сигнал, который идёт от клеток плода. Опухолевые клетки со своей ДНК будут забивать то, что сигнал идёт со стороны плода. Также могут быть такие ситуации, что у женщины давно допустим пересаженная почка, и она решила родить ребёнка. Если есть орган от донора, то это дополнительный геном и дополнительный источник шума, и тоже результат будет недостоверным. Если есть такие проблемы методика SNP не может применяться.
Потому что для уверенной оценки этого анализа процент фетальной ДНК по отношению ко всей свободной ДНК должен быть не ниже 4%. И этот процент зависит от срока беременности, чем больше срок тем больше будет эта ДНК поступать, и что самое неприятное, это зависит от массы женщины. Чем она больше, тем больше объём крови и ткани, и эта фетальная ДНК поступающая из плаценты, растворяется внутри больших объёмов, и получается общий процент фетальной ДНК по отношению ко всей материнской меньше, и мы не сможем получить результаты анализов, врач должен это понимать.
Когда процент фетальной ДНК будет ниже?
Ещё одно состояние, когда фетальная ДНК может понижаться, это анеуплоидия, которую мы пытаемся исследовать. Если у женщины имеется ребенок с синдромом Дауна или с трисомией по 13 или 18 паре, то в таком случае процент фетальной ДНК часто бывает ниже. Если мы смотрим популяцию низкого риска, допустим мы применяем НИПТ в качестве альтернативного скрининга анеуплоидии, либо применяем эту методику в качестве дополняющей нашего скрининга, и получаем что лабораторией не выявлено. В настоящее время теми исследователями, которые пишут на эту тему, это рассматривается как фактор повышения риска анеуплоидии у плода, и поэтому при анализе такой ситуации в некоторых случаях возникает вопрос.
Если мы два раза подряд не получали процент ДНК - это не ошибка лаборатории и не проблемы с забором крови, а очень часто результат того, что у пациентки есть анеуплоидия. С большей степенью вероятности вы направите её на консультацию к генетику для принятия решения по проведению уже непосредственно пренатальной диагностики, то есть биопсии ворсин хориона или амниоцентез.
Ограничения НИПТ
Конечно, чувствительность этой методики она потрясающая по сравнению с тем, какую чувствительность дают обычные методы пренатально скрининга - ультразвуковая диагностика, биохимический тест, которые мы обычно смотрим. То есть по трисомии 21 пары - 99,3% по трисомии 18 пары - 97,4%, по трисомии 13 пары - 90,7%. Специфичность 99,9% для трисомии по 21 паре. На трисомии это самый чувствительный метод пренатального скрининга.
Если посмотреть процент ложноположительных результатов по всем этим хромосомным парам, то есть одна из трисомий, которая диагностирована неправильно, то тогда интегральный риск составляет 0,72% это 1:140 и об этом нужно помнить. Мы должны говорить пациентке, что результат может быть положительным, и, скорее всего, этот результат будет свидетелем того, что у вашего плода есть трисомия, но этот результат не является окончательным. Он требует дополнительных тестов, либо биопсии ворсин хориона, либо амнеоцентез. Это важный момент, который должен знать каждый врач акушер-гинеколог. То есть мы должны чётко понимать ограничения методики на сегодняшний день, к сожалению этот анализ не является диагнозом, где мы будем уверенны на 100%, что мы нашли то что ищем.
Вероятность положительно-предсказательных значений
Положительно-предсказательное значение: вероятность того, что у пациентки с высоким риском действительно имеется беременность плодом с трисомией, то есть это тот риск, который мы получили по результатам теста. Здесь проблема этого значения зависит от той частоты, которой исследуемое состояние имеется внутри популяции. Представим себе группу женщин высокого риска скажем 40 лет и частота синдрома Дауна на вскидку будет около 1% и посмотрим популяцию в целом и возможно вероятность синдрома Дауна популяции будет составлять 1:700, то есть в несколько раз меньше. Тогда получается, что если мы смотрим наш тест внутри группы высокого риска, там, где чистота исследуемого параметра будет выше, то данное значение будет выше. А если мы его размажем по всей популяции, то есть будем делать скрининг для всей популяции, тогда частота этого значения будет понижаться, это значит, что при массовом скрининге у женщин положительно-предсказательное значение будет ниже, чем у популяция высокого риска.
И также значит, что положительно-предсказательное значение, если мы получаем синдром Дауна, будет выше, чем когда мы говорим, что будет риск синдрома Эдвардса или риск по 13 паре. Эти понятия говорят о том, что если мы применяем эту методику для всей популяции, где достаточно большой процент женщин низкого риска, то тогда процент ложно положительных результатов будет выше.
В популяции высокого риска, то есть у женщин старшего возраста, положительно-предсказательное значение для синдрома Дауна составляет 80 -90 %, у популяции низкого риска 45,5% для трисомии по 21 паре и 40 % для трисомии по 18-й паре. С этим столкнулись те страны, которые начали применять НИПТ массово, или как замену этого традиционного скрининга. Поэтому прежде чем принимать решение о прерывание беременности, что очень важное решение для женщин с результатом высокого риска, требуется подтверждение, что есть проведение подтверждающих исследований - биопсии ворсин хориона, либо амниоцентез.
Так мы исключаем очень многое, но если результат положительный лучше его дополнительно проверить, чтобы не прерывать беременность, которая не имеет синдрома Дауна, потому что тогда будет проблема. Если вы по результатам направите на аборт, а пациентка сделает анализ и принесёт вам результат, то она просто может высказать претензии к вам, почему вы меня об этом не предупредили, почему не предложили каких-то других исследований прежде чем принимать какое-то значимое решение об аборте для моей беременности и для моего ребёнка.
Вероятность отрицательно-предсказательных значений
Отрицательно-предсказательное значение отражает вероятность того, что у женщины, попавшей в группу низкого риска, может быть риск трисомии. Здесь конечно цифры очень низкие, то есть вероятность синдрома Дауна составляет 1:10000. Но есть этот один, и если вдруг, мы сказали, что там нет синдрома Дауна, а потом мы обнаружим синдром Дауна, здесь важно сказать: мы с очень высокой степенью вероятности исключаем у вашего ребёнка риск наличия синдрома Дауна, но на все 100 % это исключить нельзя. Потому что возможно, что тест будет хорошим, но всё же может быть, то что называют один на десять тысяч будет ложным.
Необходимость донести информацию до пациентки
Поэтому очень важным моментом считается то, что каждый врач-гинеколог разговаривает с пациенткой, направляя её на скрининг, на инвазивный пренатальной тест должен поговорить и объяснить, что скрининг такой возможен, и что он добровольный. То есть пока он не включён ни в какие наши приказы, что происходит в большинстве стран, которые это одобрили, и у нас он просто в каком-то подвешенном состоянии. Нужно рассказать об отличии скрининга и диагностики, то есть обсудить состояния, по которым проводится скрининг, что мы исключаем синдром Дауна, Эдвардса, Патау либо синдром Шерешевского-Тернера.
Дальше нужно говорить по поводу безопасности и сроков проведения анализов, что это просто обычный анализ крови и абсолютно безопасен для ребёнка. Проводится забор крови после 10 недель беременности и рассказать о том, что методы НИПТ бывают разнообразными зависимости от лаборатории.
Также нужно обсудить порядок действий в случае, если результат окажется положительным, что это ещё не является окончательным диагнозом, хотя и есть очень большая вероятность, что так оно и есть. Но всё-таки учитывая значимость того что речь идёт о человеческой жизни, нужно проконсультироваться у генетика или призвать на помощь CVS или амниоцентез, обсудить ограничения теста, потому что пациентка может думать, что этим тестом можно проверить все генетические заболевания, обсудить все риски и так далее. Мы очень часто сталкиваемся с ситуациями, когда врач попадая в исследуемый материал находит что-то, допустим это какой-то полиморфизм, и если есть возможность посмотреть это всё другими способами, то нужно так и поступить.
НИПТ в Лаборатории ЦИР
Расширенная панель НИПТ в Лаборатории ЦИР
