Согласно Всемирной Организации Здравоохранения (2000г.) около 10-20% супружеских пар репродуктивного возраста бесплодны, в половине случае из которых, причиной этого является мужской фактор. Для зачатия ребенка, протекания беременности без осложнений и рождения здорового потомства большую роль играет генетика, а именно тот генетический материал, который родители передадут своему будущему ребенку. Генетический материал от отца несут в себе мужские половые клетки сперматозоиды. Но как проверить, что в них не повреждена молекула ДНК? В настоящее время, особенно с повышенным применением ВРТ (вспомогательных репродуктивных технологий), в клиническую практику все увереннее входят анализы оценки генетического материала человека. Сдать анализ фрагментации ДНК сперматозоидов можно у нас влаборатории ЦИР!Спермограмма и фрагментация ДНК сперматозоидов
Основным методом диагностики мужской репродуктивной системы к способности оплодотворить яйцеклетку и тем самым, зачать ребенка, является спермограмма. Это хороший скрининговый анализ оценки мужской фертильности. Однако этого недостаточно для полной картины, поскольку анализ не определяет молекулярную структуру ДНК сперматозоидов.Показано, что до 15% мужчин с заключением в спермограмме - нормозооспермия (нормальные показатели спермы согласно ВОЗ V 2010г.) могут оставаться бесплодны по другим причинам. Сначала чешские генетики Rybar и др. в 2009 г., а затем французские исследователи Belloc с соавторами в 2014 г. приводят литературные данные, о том, что более чем у 11% мужчин с нормозооспермией выявляют значительную (более 20%) долю сперматозоидов с фрагментацией ДНК.
Что такое фрагментация ДНК сперматозоидов?
Известно, что молекула ДНК состоит из двух спирально закрученных нитей (цепей). Однако под воздействием различных факторов молекула ДНК может повреждаться, в результате чего образуются разрывы, которые могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Разрывы (фрагменты) цепи ДНК нарушают целостность молекулы и, тем самым, снижают шансы наступления и благоприятного протекания беременности.
Ферменты яйцеклетки после оплодотворения могут исправлять до 10% этих повреждений ДНК сперматозоидов, но это будет зависеть от типа повреждения и качества яйцеклетки. Остальные неисправленные разрывы ДНК ведут к нарушению генома эмбриона и остановке развития беременности на ранних сроках, в т.ч. на ранних этапах эмбриогенеза, особенно при применении метода ЭКО (экстракорпорального оплодотворения).
Исследование фрагментации ДНК сперматозоидов представляет собой определение процентного содержания сперматозоидов (индекса фрагментации) с нарушенной целостностью молекулы ДНК.
К чему приводит повышение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов?
Сперматозоиды с поврежденной ДНК могут сохранять способность к оплодотворению, но в дальнейшем в эмбриональном развитии плода могут происходить нарушения, часто приводящие к прерыванию беременности. Иногда повреждения ДНК столь значительны, что эмбрион погибает на ранних этапах развития, при которых неудается даже выявить биохимические маркеры беременности. При повышении уровня фрагментации ДНК сперматозоидов снижается частота наступления беременности, увеличивается вероятность спонтанного аборта, а также снижается вероятность успеха ЭКО.
Фрагментация ДНК сперматозоидов и мужское бесплодие в мировых исследованиях
Рис.2. Историческая хронология развития изучения ДНК фрагментации (Rex, A.S., Aagaard, J. and Fedder, J., 2017. DNA fragmentation in spermatozoa: a historical review. Andrology, 5(4), pp.622-630).
Впервые значительную связь между повреждением ДНК сперматозоидов и невынашиванием беременности показали Robinson с соавторами (Великобритания, 2012).
В канадском исследовании авторов Zini A., Albert O., Robaire B в 2014г. было показано, что повышенная фрагментация ДНК сперматозоидов приводит к уменьшению мужского потенциала фертильности, снижению частоты наступления беременности, неразвивающейся беременности, а также снижению эффективности ВРТ. Кроме того, при оплодотворении таким дефектным сперматозоидом увеличивается вероятность наличия хромосомных нарушений и врожденных пороков развития у плода.
К 2015 г. было опубликовано значительное количество литературы о связи между повышенной фрагментацией ДНК и бесплодием, и в этом же году впервые поднимается вопрос о включении теста на фрагментацию ДНК сперматозоидов в перечень рутинных методов диагностики мужского бесплодия.
Все новые и новые исследования говорят о связи между повышенной фрагментацией ДНК сперматозоидов и невынашиванием беременности (Coughlan и соавторы, Великобритания 2015г.; Leach и соав., Австралия, 2015г.; Bareh и соавт., США, 2016г.; Zidi Jrah и соав., Тунис, 2016г.).
Результаты исследования Dorostghoal и др. показали значительно более высокий уровень сперматозоидов с фрагментированной ДНК у бесплодных мужчин, чем у контрольной группы фертильных мужчин. Фрагментация ДНК сперматозоидов, может служить, как новый маркер качества сперматозоидов.
В исследовании Гентского университета Бельгии авторами во главе Comhaire в 2018г. у бесплодных пар была выявлена диагностическая корреляция между индексом фрагментации ДНК сперматозоидов и результатами программ ВРТ. А также Deng и соавторы Научного центра репродуктивной медицины в Китае исследовали 1133 цикла ВРТ и выявили статистическую корреляцию между повышенным индексом фрагментации ДНК и негативным результатом программ ВРТ.
Показания к сдаче анализа
Сдать анализ на фрагментацию ДНК сперматозоидов рекомендуется в следующих случаях:
- * бесплодие в супружеской паре;
- * привычное невынашивание беременности;
- * подготовка к вспомогательным репродуктивным технологиям (ВРТ), в т.ч. ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение), ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида), внутриматочная инсеминация;
- * неудачные попытки ЭКО;
- * обнаружение отклонений в спермограмме.
Причины повышенной фрагментации ДНК сперматозоидов
Причины фрагментации ДНК сперматозоидов не до конца изучены. Считается, что основной причиной фрагментации ДНК является оксидативный стресс, а именно повышение в сперме активных форм кислорода (АФК, Reactive oxygen species, ROS). Избыточное количество активных радикалов кислорода способно разрушать фосфолипидные мембраны и генетический материал сперматозоидов. Основным источником активных форм кислорода являются лейкоциты.
Другими внутренними факторами повышения фрагментации ДНК считают неадекватное созревание сперматозоидов (нарушение конденсации хроматина), нарушение дозревания сперматозоидов в придатках яичек и апоптоз (генетически запрограммированная гибель клеток). Важная роль апоптоза состоит в устранении дефектных клеток, у которых разрушается ДНК. Поэтому чем больше отклонений в спермограмме (астенозооспермия, олигоастенозооспермия, олигоастенозооспермия), тем выше уровень фрагментации ДНК сперматозоидов вследствие апоптоза.
Кроме того, существуют и внешние факторы, которые в той или иной степени могут повышать процент фрагментации ДНК сперматозоидов:- * возраст (старше 40 лет);
- * ожирение;
- * вредные привычки;
- * высокие температуры (злоупотребление банями/саунами);
- * хронические/острые воспалительные заболевания мужской мочеполовой системы;
- * воздействия ионизирующего излучения (лучевая и/или химиотерапия);
- * варикоцеле (варикозное расширение вен семенного канатика и яичка).
Где сдать фрагментацию ДНК сперматозоидов?
Наши клиники и лаборатории ЦИР уже 23 года работают в области репродукции. Нам доверяют многие супружеские пары с проблемами бесплодия и невынашивания беременности.
В нашей собственной лаборатории сперматологии мы проводим качественно и быстро до 15 анализов спермы, в том числе и анализ фрагментации ДНК сперматозоидов.
Наши опытные врачи-андрологи и репродуктологи помогут составить план обследования и при необходимости назначить лечение.
Методы фрагментации ДНК сперматозоидов
Существует несколько разновидностей тестов на фрагментацию ДНК. Различают прямые и непрямые методы исследования фрагментации ДНК сперматозоидов. К прямым методам относят способность выявить уже имеющиеся истинные разрывы ДНК. Непрямые методы определяют подверженность ДНК к разрывам, т.е. потенциальные разрывы, чувствительные к различным воздействиям. Несомненно, прямые методы обладают особым преимуществом перед непрямыми.Прямые методы фрагментации ДНК сперматозоидов – TUNEL, COMET и NT.
К непрямым методам широкое распространены SCSA и SCD (Halosperm).
Метод TUNEL (Transferase mediated dUTP Nick End Labeling). Наибольшей популярностью в настоящее время пользуется этот метод для оценки уровня фрагментации ДНК сперматозоидов. В эякулят добавляется специальное вещество (терминальная трансфераза), после которого разрывы молекул ДНК сперматозоидов прокрашиваются определенным цветом. Под люминесцентным микроскопом проводится подсчет здоровых сперматозоидов, на которые краситель никак не действует (красным цветом), и сперматозоидов с фрагментацией ДНК (зеленым цветом). Преимущество метода заключается в прямом мечении (маркировке) разрывов в ДНК, отсюда следует, что тест имеет высокую чувствительность и специфичность по сравнению с другими методами исследования фрагментации ДНК. Также данный метод позволяет идентифицировать одно- и двухцепочечные разрывы ДНК. Для проведения этой методики необходимо специальное оборудование и высококвалифицированный персонал лаборатории. В нашей Лаборатории ЦИР Вы можете сдать анализ фрагментации ДНК сперматозоидов методом TUNEL.
Рис.3a и 3b. Препараты эякулята под люминесцентным микроскопом. Сперматозоиды с фрагментацией ДНК (зеленым цветом) и сперматозоиды без фрагментации ДНК (красным цветом), окрашенные методом TUNEL.
Метод COMET (Single-cell gel electrophoresis assay, гель-электрофорез единичных клеток) основан на принципах электрофореза, распределяя высоко- и низкомолекулярные ДНК, из которых последняя при электрофорезе напоминает хвост кометы. Чем больше клеток с «хвостом кометы», тем больше имеет место быть фрагментации ДНК. Данный метод высокочувствительный, но требует специального оборудования, не подходящего для использования в клинической лаборатории.
Рис.4. Метод ДНК-комет.
Метод NT (ник-трансляции, ISNT, In-Situ Nick Translation assay) основан на включении радиоактивного тимидина в 3' -ОН концы фрагментов ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. В отличие от метода TUNEL данный метод ISNT определяет только одноцепочечные разрывы.
В методах COMET и NT отсутствуют стандарты порогового значения нормы, поэтому они используется только в исследовательских целях.
Метод SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) или определение структуры хроматина по Эвенсону. Это первый разработанный метод определения фрагментации ДНК сперматозоидов. Сначала в образец со сперматозоидами добавляют кислый денатурирующий раствор, а затем специальный краситель акридиновый оранжевый. При связывании красителя с целой двухцепочечной молекулой ДНК наблюдается зеленое свечение, при связывании с разрушенной денатурированной одноцепочечной молекулой ДНК – красное свечение, при наличии умеренной степени повреждения ДНК – желтое свечение. Все это количественно подсчитывается с помощью проточной цитометрии, основой которого является лазерный луч, способный разделить оба типа свечения. Данный метод достаточно высоко чувствителен и специфичен. Сдать фрагментацию ДНК сперматозоидов методом SCSA можно у нас в лаборатории ЦИР!
Метод SCD (Sperm Chromatin Dispersion) или его модификация Halosperm (HALO тест) основан на обнаружении разрывов ДНК по дисперсии хроматина вокруг ядра клетки после гидролиза. Сперматозоиды обрабатывают раствором кислоты, затем после инкубации клетки прокрашивают и просматривают в световом микроскопе. Сперматозоиды, которые содержат целую ДНК, образуют ореол дисперсии («halo-эффект»). Сперматозоиды с фрагментированной ДНК образуют минимальный ореол или не образуют его вообще. Метод прост в использовании, но значительным минусом его является относительно низкая чувствительность и специфичность по сравнению с другими методами исследования фрагментации ДНК.
Рис. 5. Препарат эякулята под световыми микроскопом. Сперматозоиды с целой ДНК (с ореолом дисперсии - «halo-эффект») и сперматозоиды с фрагментированной ДНК (без ореола).
Различают также относительно новый метод исследования фрагментации ДНК – метод DBD-FISH (DNA Break Detection-Fluorescence In Situ Hybridization). В ходе теста сперматозоиды вначале обрабатываются щелочным раствором, который разрушает белки и деспирализует ДНК, а затем средой, содержащей флуоресцентно меченые ДНК-зонды. Зонды связываются с одноцепочечной ДНК. Чем выше степень фрагментации ДНК, тем больше образуется одноцепочечных фрагментов и тем выше степень фрагментации. Этот метод может быть использован для обнаружения повреждения ДНК в определенных областях последовательности генома. В настоящее время технология находится на стадии экспериментального изучения.
Какой метод выбрать?
Как правило, лечащий врач-андролог при назначении указывает метод исследования фрагментации ДНК сперматозоидов, так как в некоторых клинических случаях может быть предпочтителен тот или иной метод. В остальных случаях пациенту приходится самому выбирать метод анализа, руководствуясь в основном ценой исследования.
В научных исследованиях наибольшую прогностическую значимость с позиции успеха ВРТ показывали методы TUNEL и COMET (L. Simon и др., США, 2014г.; Cissen M. и др., Нидерланды, 2016г.).
В настоящее время наибольшее распространение получил метод TUNEL, так как именно этот метод был использован в большей части исследований, посвященных изучению влияния фрагментации ДНК сперматозоидов на репродуктивные исходы и фертильность.
Прямой метод TUNEL выявляет как одноцепочечные так и двуцепочечные разрывы молекулы ДНК сперматозоидов, таким образом давая больше информации специалисту для оценки вероятности успеха того или иного метода ВРТ.
Что делать если повышен уровень фрагментации ДНК сперматозоидов?
В норме индекс фрагментации должен быть ниже 15%. Всем пациентам с мужским бесплодием, в том числе, ассоциированным с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов, рекомендуется отказаться от вредных привычек и других факторов риска, вести здоровый образ жизни и поддерживать полноценный рацион питания.
При выявлении у пациента с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов с варикоцеле - целесообразна его хирургическая коррекция. К консервативным методам лечения относится назначение антикосидантной терапии и терапии с применением рекомбинантного ФСГ.
Запишитесь к нашим специалистам и получите квалифицированную консультацию по результату анализа, а также рекомендации по лечению при необходимости. Записаться на консультацию в ЦИР
