ВОПРОС ВРАЧУ:

Мышь из стволовой клетки

Материал подготовлен урологом-андрологом ЦИР Живулько А.Р.

Клеточные технологии

Одной из многообещающих и быстро развивающихся отраслей современной биологии и медицины являются клеточные технологии. В рамках этой отрасли существует множество перспективных направлений, представляющих интерес с позиции их прикладного применения в решении насущных медицинских проблем сегодняшнего дня, в том числе и бесплодия.

В основе идеи преодоления бесплодия с помощью клеточных технологий лежит способность стволовых клеток при определенных условиях дифференцироваться в специализированные клетки, способные к мейозу с образованием гаплоидных половых клеток.

Развитие половых клеток млекопитающих

У млекопитающих процесс развития половых клеток начинается с 4 недели эмбриогенеза, когда в первичную гонаду начинают активно мигрировать первичные половые клетки – гоноциты. В дальнейшем эти клетки предшественники вовлекаются в процесс пролиферации и дифференцировки с образованием сперматогоний (овогоний) и сперматоцитов (овоцитов), которые вступают в мейотическое деление с образованием в конечном счете гаплоидных половых клеток.

Под воздействием цитокинов, продуцируемых экстраэмбриональными тканями, мышиные и человеческие эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные клетки могут дифференцироваться в эпибластоподобные клетки, которые, в свою очередь, могут дифференцироваться в гоноцитоподобные клетки в условиях in vitro(3,8). Для получения гаплоидных половых клеток, которые можно было бы использовать в ЭКО, гоноцитоподобная клетка должна подвергнуться мейозу in vitro.

Однако именно воссоздание процесса мейоза в условиях in vitro оставалось главным препятствием на пути получения функциональных гамет in vitro. В прошлом уже были достигнуты значительные успехи в направлении получения женских половых клеток – ооцитов: еще в 2003 году Hübner и коллегами были получены мышиные ооциты из эмбриональных стволовых клеток(1), а в 2012 году Hayashi и коллегам удалось получить здоровые особи, используя мышиные яйцеклетки, выращенные из эмбриональных стволовых клеток(2).

сперматогенез

Рисунок врача лаборатории ЦИР Бабкеевой Э.Р.

Сперматозоиды из стволовой клетки

До недавнего времени значительно меньше внимания уделялось разработке методики получения мужских половых клеток in vitro. В 2011 году уже упомянутым коллективом исследователей из Университета Киото полученные in vitro гоноцитоподобные клетки были пересажены в тестикулы мыши, из которых впоследствии развивались сперматозоиды(3). Однако риск онкогенеза препятствует использованию такого подхода в экспериментах с людьми. Таким образом, способность человеческих гоноцитоподобных клеток образовывать сперматозоиды остается неизвестной.

Geijsen и коллегами были получены мышиные гаплоидные мужские половые клетки в условиях in vitro, которые при интрацитоплазматическом введении в ооцит приводили к развитию бластоцисты(4). Испанские специалисты сообщают о получении гаметоподобных гаплоидных клеток уже из человеческих эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных клеток(5). Также Easley и коллегам удалось получить сперматидоподобные клетки из человеческих стволовых плюрипотентых клеток(9). Но не в одном из этих исследований полученные гаметоподобные половые клетки не были с успехом использованы для получения здоровых организмов, которые впоследствии могли бы давать здоровое потомство.

Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells In Vitro

25 февраля 2016 в журнале Cell была опубликована статья «Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells In Vitro», в которой коллективом специалистов Государственной Лаборатории Репродуктивной медицины, Департамента Гистологии и Эмбриологии Медицинского Университета г. Нанкин (Китай) сообщается об успешном получении мышиной сперматидоподобной клетки из гоноцитоподобной клетки в условиях in vitro, а также успешного дальнейшего использования полученной сперматидоподобной клетки в процедуре ИКСИ, в результате которой родились здоровые особи, которые впоследствии производили здоровое потомство(6).

Инициация мейоза в условия in vitro была осуществлена путем совместного культивирования гоноцитоподобных клеток и ранних постнатальных тестикулярных клеток KITW/KITW-V мыши с добавлением активина А, ретиноевой кислоты и костных морфогенетических белков ВМР 2,4 и 7. Для гормональной стимуляции формирования гаплоидной сперматидоподобной клетки на седьмые сутки морфогены: активин А, ретиноевая кислота и костные морфогенетические белки ВМР 2,4 и 7 удалялись из среды, после чего в культуру добавляли фолликулостимулирующий гормон, экстракт бычьего гипофиза и тестостерон. Первые сперматидоподобные клетки образовывались на десятый день культивирования. На четырнадцатый день культивирования клеточная культура на 14-20% состояла из сперматидоподобных клеток.

Для оценки целостности генома из полученных сперматидоподобных клеток были отобраны 8 клеток. Из них 6 были гаплоидными, одна имела хромосомные делеции и одна была диплоидной.

Оценка функциональных возможностей полученных сперматидоподобных клеток была произведена с помощью интрацитоплазматической инъекции этих клеток в ооциты. 379 ооцитов было подвергнуто введению сперматидоподобных клеток, в результате чего было получено 317 двухклеточных эмбрионов. Имплантация этих эмбрионов привела к рождению 9 здоровых особей, достигших репродуктивного возраста и давших здоровое потомство.

Таким образом, в данном исследовании авторы впервые продемонстрировали методику культивирования сперматидоподобных клеток in vitro, доказали их функциональность с помощью процедуры ИКСИ. Ими впервые полностью представлен путь от эмбриональной стволовой клетки до здоровой особи способной к воспроизводству потомства. Также необходимо отметить, что исследование отвечает золотому стандарту, предложенному для культивирования половых клеток in vitro(7).

Внедрение в практику

Данная работа является значительным достижением в области клеточных технологий, о чем заявляют не только авторы работы, но и ведущие специалисты этой области во всем мире. Исследование создало предпосылки для возможного применения такого подхода для лечения мужского бесплодия в будущем.

На пути к клиническому внедрению метода существует множество преград. В исследовании были использованы эмбриональные стволовые клетки, которые отсутствуют в зрелом организме, методика же должна быть воспроизводима с использованием индуцированных плюрипотентных клеток, которые возможно добыть у взрослого человека. Помимо этого, развитию технологии будут препятствовать серьезные вопросы юридического и этического характера.

В случае если все препятствия будут преодолены и будет разработана технология выращивания функциональных человеческих гамет в условиях in vitro, такая методика может стать вариантом выбора для бесплодных мужчин с необструктивной азооспермией тестикулярного генеза, у которых невозможно добыть сперматозоиды и продолговатые сперматиды (мужчин перенесших в детском возрасте химиотерапию, с Y-хромосомными полными делециями AZFa, b, тестикулярной атрофии вследствие травмы, нарушения васкуляризации, идиопатических форм и др.) – ситуации, в которых единственным выбором сегодня остается использование спермы донора.

Литература

  1. Karin Hübner1, Guy Fuhrmann3, Lane K. Christenson4, James Kehler1, Rolland Reinbold1, Rabindranath De La Fuente2, Jennifer Wood4, Jerome F. Strauss III4, Michele Boiani1, Hans R. Schöler1,* Derivation of Oocytes from Mouse Embryonic Stem Cells. Science 23 May 2003:Vol. 300, Issue 5623, pp. 1251-1256
  2. Katsuhiko Hayashi Sugako Ogushi1,4, Kazuki Kurimoto, So Shimamot Hiroshi Ohta, Mitinori Saitouю. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell–like Cells in Mice. Science 16 Nov 2012: Vol. 338, Issue 6109, pp. 971-975
  3. Katsuhiko Hayashi, Hiroshi Ohta, Kazuki Kurimoto, Shinya Aramaki, Mitinori Saitou Reconstitution of the Mouse Germ Cell Specification Pathway in Culture by Pluripotent Stem Cells. Cell Volume 146, Issue 4, p519–532, 19 August 2011
  4. N. Geijsen, M. Horoschak, K. Kim, J. Gribnau, K. Eggan, G.Q. Daley . Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells. Nature, 427 (2004), pp. 148–154
  5. Eguizabal, N. Montserrat, R. Vassena, M. Barragan, E. Garreta, L. Garcia-Quevedo, F. Vidal, A. Giorgetti, A. Veiga, J.C. Izpisua Belmonte. Complete meiosis from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells, 29 (2011), pp. 1186–1195
  6. Quan Zhou, Mei Wang, Yan Yuan, Xuepeng Wang, Rui Fu, Haifeng Wan, Mingming Xie, Mingxi Liu1, Xuejiang Guo1, Ying Zheng, Guihai Feng, Qinghua Shi, Xiao-Yang Zhao, Jiahao Sha1, Qi Zhou. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells In Vitro. Cell Volume 18, Issue 3, 3 March 2016, Pages 330–340
  7. Handel MA, Eppig JJ, Schimenti JC. Applying "gold standards" to in-vitro-derived germ cells. Cell 2014 Jun 5;157(6):1257-61. doi: 10.1016/j.cell.2014.05.019.
  8. N. Irie, L. Weinberger, W.W. Tang, T. Kobayashi, S. Viukov, Y.S. Manor, S. Dietmann, J.H. Hanna, M.A. Surani. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell, 160 (2015), pp. 253–268
  9. Charles A. Easley, Bart T. Phillips, Megan M. McGuire, Jennifer M. Barringer, Hanna Valli, Brian P. Hermann, Calvin R. Simerly, Aleksander Rajkovic, Toshio Miki, Kyle E. Orwig, and Gerald P. Schatten. Direct Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Haploid Spermatogenic Cells. Cell Rep. 2012 Sep 27; 2(3): 440–446.


Rambler's Top100